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1. siRNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法
siRNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法有化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)、電穿孔法、磷酸鈣共沉淀技術(shù)、顯微注射和載體導(dǎo)入技術(shù)等。技術(shù)的選擇要考慮轉(zhuǎn)入時(shí)細(xì)胞的承受能力、細(xì)胞對(duì)病毒感染的敏感性、細(xì)胞生長特性等實(shí)驗(yàn)條件的限制。對(duì)于貼壁細(xì)胞來講化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)比較合適，而對(duì)于懸浮細(xì)胞，電穿孔更有效。
2. 轉(zhuǎn)染試劑的選擇
在選擇轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，首先考慮的是特定的細(xì)胞株，而不是被導(dǎo)入細(xì)胞中的物質(zhì)。在試劑的選擇上建議選擇線性PEI轉(zhuǎn)染試劑。
3. 篩選轉(zhuǎn)染試劑
好的轉(zhuǎn)染試劑有以下特點(diǎn)：如下表
特性 | 程度 | 實(shí)例 |
毒性 | 小 | 對(duì)細(xì)胞的毒性小。 |
轉(zhuǎn)染率 | 高 | 在siRNA轉(zhuǎn)染過程中有較高成功率 |
導(dǎo)入效果 | 準(zhǔn)確 | 在mRNA水平檢測(cè)siRNA導(dǎo)入的效果比用看家基因的siRNA陽性對(duì)照檢測(cè)更準(zhǔn)確。 |
4. 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染過程中死亡的處理方法
如果細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后大多數(shù)死亡，那就說明轉(zhuǎn)染條件不適合細(xì)胞生存，需要進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。在優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件時(shí)需要考慮的因素：轉(zhuǎn)染試劑（線性PEI轉(zhuǎn)染試劑）和細(xì)胞特異性條件。例如：siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間、細(xì)胞傳代數(shù)和細(xì)胞密度等。
5. 提高難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的方法以及轉(zhuǎn)染效率的確定
如何提高難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率是目前研究的一個(gè)技術(shù)難題。一般推薦使用電轉(zhuǎn)移法，該方法對(duì)細(xì)胞的損傷比較大，所以這種方法不太合適。熒光標(biāo)記siRNA是熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)常用的檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率的方法。
6. 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡的原因及轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化
死亡原因 | 解決策略 | 如何優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件：包括轉(zhuǎn)染前調(diào)整細(xì)胞密度、轉(zhuǎn)染濃度、檢測(cè)時(shí)間等。
|
脂質(zhì)體毒性 | 優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件 | |
轉(zhuǎn)染濃度過高 | ||
轉(zhuǎn)染前的細(xì)胞狀態(tài)不佳 |
選擇像線性PEI轉(zhuǎn)染試劑這種毒性小的轉(zhuǎn)染試劑也可以達(dá)到優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件的目的。另外，如果siRNA靶向的基因?qū)S持細(xì)胞生長非常重要，那么細(xì)胞死亡的現(xiàn)象可能是由基因干擾。如果檢測(cè)受到細(xì)胞死亡的影響，可以適當(dāng)調(diào)整檢測(cè)時(shí)間。
